制備型超高速離心機(jī)的幾種分離方法

A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。 
　　差速離心是一種常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時裝滿了均一的樣品溶液。通過在速度下時間的離心后，就可得到兩個部份：沉淀和上清液。 
　　通常在次離心時把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時間要選擇得當(dāng)，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心，直到達(dá)到所需要的分離純度為止。 
　　差速離心的特點是操作簡單，但分離純度不高。 
B.密度梯度離心法：可以同時使樣品中幾個或全部組份分離，具有很好的分辨率。 
1)速率區(qū)帶法(rate zonal)： 
　　根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下： 
　　在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。 
　　將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。 
　　由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動的速度不一樣，所以經(jīng)過離心后會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。 
　　注意：樣品粒子的密度大于梯度液注中任一點的密度。離心過程在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。 
2)等密度離心法(isopycnic)： 
　　根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。 
　　密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點。注意：平衡后粒子的分離由其密度決定，與時間無關(guān)，此時再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對位置。 2.密度梯度分析法 
1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇： 
A、應(yīng)具備的性質(zhì) ： 
　　梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是： 
　　· 所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。 
　　· 具有某些性質(zhì)，如折射率，據(jù)此可測定它的濃度。 
　　· 所形成的溶液粘度低。 
　　· 不損傷所分離的樣品。 
　　· 離心分離后容易除去。 
　　· 不妨礙分離積分的分析。 
B、常用介質(zhì)種類： 
　　表一、常用梯度材料在20℃密度 
B.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍： 
　　表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用 
　　+++很好 ++好 +可以 --不適用 
　　表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度 
(2)、梯度溶液的準(zhǔn)備： 
　　計算 
　　稀釋(本文第三章部分) 
(3)、梯度形狀 
　　梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。(如下圖) 
　　梯度形狀對于分離是否成功重要： 
　　常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進(jìn)分離能力，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。 
B.梯度柱制備： 
　　梯度液柱可以用手工或梯度儀制備 
　　半注法： 
　　為縮減離心時間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì)，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油。